前言

本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省优德体育业科学院奶牛研究中心、山东天龙牧业科技有限公司、山东省畜牧总站、山东奥克斯生物技术有限公司。

本标准主要起草人：王长法、高运东、张燕、张思聪、王玲玲、朱涛涛、张瑞涛、黄金明、仲跻峰、侯明海、王银朝、闫金华、沈善义。

德州驴冷冻精液生产技术规程

1. 范围

本标准规定了公驴要求、冷冻精液生产的术语和定义、器械清洗和消毒、离心液及稀释液配制、采精、精液处理、精液冷冻、冻精解冻、冻精活率检查和检验规则、包装、贮存及运输。

本标准适用于德州驴冷冻精液生产，其它品种驴冷冻精液生产可参照执行。

2. 规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T 5458  液氮生物容器

GB/T 24877-2010  德州驴

NY/T 1234-2006  牛冷冻精液生产技术规程

3. 术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

德州驴（Dezhou Donkey）

原产地为山东省鲁北平原沿渤海各县、肉挽兼用的大型地方驴品种。

德州种公驴（Dezhou Jack）

符合GB/T 24877-2010 中种用标准且等级评定二级以上的公驴。种公驴体质健康，性能力旺盛，生殖系统无异常，无传染性疾病。种公驴外周血检测染色体正常、无遗传性疾病。

台驴（Teaser Jenny）

能引诱德州公驴性欲、勃起、以供其爬跨的同种动物或模型。

假阴道（Artificial Vagina）

模拟母驴阴道环境条件人工制作的采精器具。其形状呈圆筒形，由外壳、内胎、内衬和集精杯等组成，主要部件构造与牛用的基本相同，但大小有别。外壳长约55 cm，形似暖水瓶，内径14 cm；中部有15.5 cm长的手柄，便于采精时把握；侧面有注水孔。采精杯为一广口不锈钢保温杯，容量300 mL。　

3.5　

原精液（Raw Semen）

采集后未经离心、稀释的精液。

3.6

精液品质检查 (Semen Examination)

鉴定精液质量的一种手段，即对影响精液质量的各项指标进行检查分析。

3.7　

精液离心液 (Semen Centrifugate)

保护精子在离心时不受损伤、延长其存活时间的液体。

3.8

精液稀释液（Semen Diluent）

保护精子延长其存活时间及增加精液容量的液体。

3.9　

细管冻精(Straw Frozen Semen)

精液冷冻类型之一，将精液分装到塑料细管中进行冷冻保存，常用的为0.5 mL。

4. 器械清洗和消毒
   4. 玻璃器皿的清洗和消毒

参照NY/T 1234-2006的4.1执行。

4. 假阴道的清洗

假阴道的清洗参照NY/T 1234－2006的4.2执行。

内胎的清洗：使用后的内胎可用加有家用洗涤剂的30 ℃～40 ℃ 温水洗涤正反两面，洗去表面的润滑剂，并用自来水清洗3遍～5遍，至冲洗干净，再用蒸馏水逐个冲洗3遍～5遍。用两个吊在厨柜顶部的夹子对称夹住内胎一端，光滑面向内，使内胎垂直悬挂在厨内晾干。不得在阳光下曝晒或在干燥箱中加热干燥。不宜将内胎平放在盒内或袋内。内胎应挂在厨柜内，直到下次使用时取出。使用前，用75 %酒精棉球消毒内胎内壁。

4. 其它器械的消毒

制作冷冻精液所用的器械事先要进行消毒。漏斗、金属镊子、药匙、胶塞和吸管胶头等都用75 %的酒精棉球擦拭消毒，待酒精挥发尽后方能使用，细管用冷冻架，使用前放置在紫外灯下消毒30 min。

4. 载玻片和盖玻片的清洗

检查精液质量时所使用的载玻片和盖玻片，用后应立即浸泡于75 %酒精中，清洗后用洁净的纱布擦拭干净备用。

4. 纱布的清洗消毒

生产用的纱布在使用后要定期进行清洗、消毒。塑料细管、细管包装用塑料管及纱布袋放置在紫外灯下照射消毒30 min后方可使用。

5. 离心液、稀释液配制
   5. 离心液、稀释液配方　　

参见附录B。

5. 离心液、稀释液配制方法
   1. 稀释用水

配制离心液、稀释液应使用双蒸水或超纯水（18.2兆欧）。

1. 药品称取及保存

称量药品应使用万分之一电子天平，天平应放置在平稳的工作台上，保持清洁干燥。称取药品时，盘内垫以称量纸，校零后方可称量。称量时应按照使用说明进行操作。

化学药品称量取用后，应立即将瓶口盖严，以免灰尘、杂菌等污染，防止分解和潮解。称量时药匙应一对一使用。

1. 卵黄的取用

参照NY/T 1234-2006的5.2.4执行。

1. 离心液、稀释液的配制
   1. 所用试剂均为分析纯。
   2. 离心液、稀释液的配制步骤如下：

• 离心液配制：按附录B称取 Tris、柠檬酸和葡萄糖，放入烧杯中，用量筒量取双蒸水约800 mL，倒入烧杯中，加入青霉素、链霉素，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，定容至1000 mL,定容后经0.22 μm滤器过滤除菌，置于4 ℃冰箱中备用，存放时间不宜超过两周；
• 稀释液配制：用量筒取适量离心液，加入20 %卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，置于4 ℃冰箱中过夜分层。之后，去除上层泡沫，将稀释液中层倒入烧杯中，下层沉淀弃去。稀释液经4000 rpm/min离心3次，每次30 min，去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，置于4 ℃冰箱中备用，但存放时间不宜超过24 h。

6. 采精
   6. 德州种公驴的要求

采精前将种公驴全部体表擦拭干净，阴茎龟头用自来水冲洗干净，并用蘸有84消毒液或者新洁尔灭的消毒毛巾擦干。

6. 采精准备
   1. 采精场所的要求

采精场所应保持宽敞（面积在100 m²以上）、安静，地面保持清洁卫生并铺以防滑设施，以免种公驴采精时滑倒。

1. 台驴的准备

选择健壮、性情温顺、无疫病的发情母驴做台驴。将台驴保定于采精架（高80 cm,长1.2 m）内。台驴的外阴、臀部应擦洗干净，尾巴用消毒纱布包裹。

1. 仪器设备的准备

预热恒温箱和水浴锅，使其处于45 ℃～50 ℃工作状态，将采精用具规则地摆放在操作台上，假阴道润滑剂（可用离心液代替）水浴加热到45 ℃。

1. 假阴道的准备

安装假阴道前应先洗净双手，并用75 %的酒精消毒。在安装假阴道时，首先将清洁的内胎安装固定在假阴道壁上，松紧适中，外套一层塑料薄膜。把集精杯安装在假阴道的下端，上覆4层无菌纱布，并适当固定。向内胎内注入4500 mL～5000 mL  45 ℃～47 ℃的温水，内腔温度为40 ℃～42 ℃。

根据公驴阴茎差异，适当的调整内腔压力和温度，温度最高不得超过43℃。通过气卡向内胎内充气，使假阴道有适度（假阴道口呈三角形状为宜）的压力，锁住气卡。采精前在假阴道内胎的前三分之二处用消毒纱布均匀涂抹适量离心液。

6. 采精方法
   1. 采精操作

采精时把待采公驴牵到采精室内的台驴处，阻止其爬胯2～3 min，使其阴茎充分勃起。采精员右手持假阴道，假阴道外口端斜朝向地面，站在公驴右前侧，待公驴爬跨时，左手轻扳阴茎，并与持假阴道的右手配合，迅速将阴茎引入假阴道中，假阴道条件适宜，公驴阴茎抽动并贴紧台驴臂部，尾根有节奏摆动即开始射精，完成射精后，公驴随即而下，此时，采精员右手紧握假阴道，随公驴阴茎而下，待公驴前肢落地时，缓慢地把假阴道脱出，立即将假阴道外口斜向上方，打开气卡放水，使精液尽快地流入集精杯内，然后小心地取下集精杯，迅速转移至精液处理室。安装好的假阴道只能使用一次，不得重复使用。

1. 采精频率

成年公驴可施行隔日采精一次，每周采精3次～4次。

1. 采精后的处理

采精后应及时清扫场地并用水冲洗干净。假阴道等采精器械清洗干净后应尽快消毒。

6. 精液处理
   1. 准备

接触精液的器皿（包括离心、稀释用玻璃及塑料器材）应提前2 h放在37 ℃恒温箱中，离心液(配方见附录B)提前2 h放在37 ℃恒温水浴箱中备用，稀释液置于室温备用。

1. 预处理

采集的原精液传递入精液处理室后，把集精杯放入34 ℃的恒温水浴箱中。精液用4层消毒纱布过滤，然后用肉眼观察原精液的颜色，正常精液色泽呈乳（灰）白色或淡黄色，记录原精液量（mL）。

1. 精液质量检查

取精液一滴，滴于载玻片上，加盖盖玻片，然后在配有38 ℃恒温装置的相差显微镜上评定活率。活率用百分率表示，例如70 %或0.7。合格精液的精子活率≥70 %(即0.70)，镜检活率合格后方可进行稀释。

1. 密度测定

按精液密度测定仪的操作规程准确测定精液的密度，合格精液的精子密度≥1.0×10⁸  mL。

根据射精量、精子活率、密度、离心回收率（80 %），计算出制作的细管数和应加稀释液用量。填写冻精生产记录。

6. 离心、稀释、封装和平衡

向原精液中，按1:1的比例加入离心液，然后在22 ℃放置10 min，之后按1850 rpm/min， 离心15                                                                                                    min，去掉上清液，将各离心管中的粥状精液用稀释液进行最后稀释。精液稀释按两步法进行：先加入最终稀释量的1/4 ，经初步稀释的精液先在22 ℃下放置10 min，然后，加入剩余的稀释液。最终稀释完的精液移入一大的容器内，用预先按附录A的规定打印好的0.5 mL细管分装精液，然后超声波封口。把分装后的细管精液放入不透明的开盖的塑料盒内，再把塑料盒放入4℃的冷藏柜中平衡3 h～4 h。也可用细管一体机进行分装操作，可在完成灌装与封口后即刻进行喷墨印字。

6. 精液冷冻
   1. 上架

参照NY/T 1234－2006的8.1规定执行。如同一架上有不同公驴的细管精液，应分开码放，两头公驴之间要隔开一些距离，以免混淆。

1. 冷冻

建议使用全自动冷冻仪。使用时首先在电脑中设置好冷冻的最佳温度曲线，冷冻仪与低温柜应尽量靠近，开启液氮罐阀门把冷冻仪降温至4 ℃，关闭风扇电源，待风扇完全停止后把已排满待冻细管精液的冷冻架迅速放入冷冻仪，盖严盖子按电脑预先设定好的最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程。如果冻精细管数量不足时，要填充备用塑料管和细管架以保持最佳冷冻曲线程序自动完成冷冻过程，确保冻精质量。

1. 收集

冷冻完成后，打开冷冻容器盖子，冻精按公驴号投入盛满液氮的不同提筒中，细管的超声波封口端在上，棉塞封口端在下，不得倒置，以免细管棉塞端的爆脱，并迅速浸泡在液氮中。

6. 冻精解冻

按NY/T 1234－2006的9规定执行。

6. 冻精质量检验
   1. 冻精质量检验
      1. 冻精质量检验采用镜检方法。
      2. 冻精镜检所用设备器材和检查方法同 6.4.3。
      3. 合格的种公驴冷冻精液应符合以下标准：

1. 冻精细管无裂痕，两端封口严密，印制的标志清晰；
2. 每管细管冻精保证 0.5 mL的精液量；
3. 精子活率 ≥ 0.35；
4. 呈直线前进运动的精子数（有效精子数）≥0.25亿/支；
5. 精子畸形率 ≤ 20 %；
6. 细菌菌落数 ≤ 1000 个。
   1. 不合格冻精应废弃；合格后的冻精方可进行包装。
7. 细菌菌落数

按NY/T 1234-2006的10.2规定执行。每二个月抽检一次。

1. 检验规则
   1. 冻精产品的质量应由相对独立的技术人员负责检测与监督，配种使用前按每头公驴每批号的产品进行外观和活率的检验，经质检员检验合格并出具合格证后，才可作为合格品使用。
   2. 每季度对每头公驴的冻精产品型式进行1～2次的检验。
   3. 当生产冻精的重要原材料、器件（如冷冻仪、分装机等）等有重大改变影响到产品质量时必须做型式检验。
6. 冻精包装

细管冻精有两种包装方法。

1. 指姆管包装

用细管计数分装机进行包装时，包装应在-140 ℃以下的环境中进行，包装后的细管冻精其棉塞端应在指拇管（塑料管）的底部，不得倒置。指拇管的内径应均匀一致。将装有细管冻精的指拇管放入液氮灌中的提筒内。

1. 纱布袋包装

用纱布袋进行包装时，在其上预先填写冻精内容（生产单位、公驴编号、支数、活率、生产日期），浸入液氮预冷后再装入细管冻精，然后将其放入液氮罐中。

6. 冻精贮存
   1. 冻精应贮存于液氮罐的液氮中，贮存冻精的低温容器应符合GB/T5458标准的规定。
   2. 设专人保管，每周定时加一次液氮，冻精应始终浸在液氮中。
   3. 冻精保管人员应经常检查液氮罐的状况，如发现液氮罐外壳结白霜，立即将精液转移入其它液氮罐内保存。包装好的冻精由一个液氮罐转换到另一个液氮罐时，在液氮罐外停留时间不得超过5 s。取存冻精后要盖好液氮罐盖塞，在取放盖塞时，要垂直轻拿轻放，不得用力过猛，防止液氮罐盖塞折断或损坏。移动液氮罐时，不得在地上拖行，应提握液氮罐手柄抬起罐体后再移动，要轻拿轻放，严禁震荡、撞击。置于阴暗凉爽处，并注意室内通风。
   4. 不同个体公驴的冻精可用不同颜色包装加以区别。
   5. 贮存冻精的容器每年至少清洗一次。
6. 冻精运输
   1. 冻精运输过程中要有专人负责，液氮罐不得横倒、碰撞及强烈振动。
   2. 冻精应始终浸在液氮中。

 附录A

（规范性附录）

德州驴细管冷冻精液标记方法

细管冷冻精液标记由十八位数四部分组成，排列顺序如下：

1. 第一部分：公驴站代号四位数；
2. 第二部分：品种代号三位数；
3. 第三部分：冻精生产日期六位数；
4. 第四部分：公驴编号五位数。

第三部分冻精生产日期六位数按年月日顺序排列，年月日各占二位数字，年度的后两位数组成年的二位数，月日不够二位的，月日前分别加“0”补充为二位数。第四部分公驴编号取该驴编号的后五位数。部分与部分之间空一个汉字（二个字节），第一、第二部分用汉语拼音大写字母表示。标记的字迹必须清晰易认。

标记示例：

• SDOX 为山东省奥克斯生物技术有限公司代号；

        DZL  为德州驴的品种代号；

        120316  为2012年3月16日的生产日期代号；

        06003  为该公驴编号。

附录B

（资料性附录）

德州驴精液离心液和冷冻精液稀释液配方成份及其浓度

B.1 精液离心液配方成份及其浓度

见表B.1。

                            B.1 离心液配方（总体积为1000 mL）

• 配置完成后经 0.22 μm 滤器过滤除菌，4 ℃保存，保存时间不超过14 d。

B.2 稀释液配方

用量筒取适量离心液，加入20 %卵黄，用封口膜封好口后，上下颠倒混匀，置于4 ℃冰箱中过夜分层。之后，去除上层泡沫，将稀释液中层倒入烧杯中，下层沉淀弃去。稀释液经4000 rpm/min离心3次，每次30 min，去除离心后的稀释液表层杂质及底层沉淀，取中层倒入盐水瓶或蓝口瓶中，加入甘油，用磁力搅拌器充分搅拌均匀后，置于4 ℃冰箱中备用，但存放时间不宜超过24